📋 实验流程
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蛋白提取（裂解细胞）
30 min用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解细胞，离心取上清（即蛋白溶液）。
💡 技巧 全程冰上操作，防止蛋白降解。
⚠️ 注意 裂解前务必加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂，否则磷酸化蛋白会丢失。
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2
蛋白定量（BCA 法）
30 min用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，保证每个泳道上样量一致。
💡 技巧 同板做 BSA 标准曲线，定量更准。
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3
SDS-PAGE 电泳
1.5 h蛋白变性后上样，按分子量在凝胶中分离。
💡 技巧 上样前加 loading buffer 95°C 变性 5 分钟。
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4
转膜（湿转/半干转）
1 h把凝胶上的蛋白转移到 PVDF/NC 膜上。
⚠️ 注意 PVDF 膜务必先用甲醇活化约 15 秒，再用转膜缓冲液平衡。
⚠️ 注意 胶在负极侧、膜在正极侧，蛋白才向膜迁移，放反就白做。
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5
封闭
1 h用脱脂奶粉/BSA 封闭膜上的非特异性结合位点。
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6
抗体孵育（一抗 + 二抗）
过夜 / 1 h先用一抗识别目标蛋白，再用带标记的二抗结合一抗。
💡 技巧 每次抗体孵育后用 TBST 洗 3 次、每次 5–10 分钟，可显著降低背景。
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7
⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 转膜方向反了：胶在负极侧、膜在正极侧，蛋白才从胶“跑”向膜，放反就白做。
- ② 一抗浓度过高：背景一片黑，先按说明书稀释，不够再慢慢加。
- ③ 上样量不均：一定要先做蛋白定量，否则条带深浅没意义。
- ④ PVDF 膜忘了用甲醇活化：不活化膜是疏水的，蛋白贴不上去。
- ⑤ 洗膜不充分：封闭或抗体孵育后 TBST 洗够 3 次，否则背景高。
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+条带出现拖尾怎么办？
通常是样品降解、上样量过大或电压过高。保持冰上操作、减少上样量、降低电压。
+转膜不完全（大分子量蛋白丢失）怎么办？
延长转膜时间、转膜缓冲液加 SDS，或对大分子蛋白降低甲醇浓度。
+完全没有信号，可能哪里出了问题？
排查：① 一抗二抗不匹配 ② 忘加 ECL 底物 ③ 转膜方向 ④ 抗体稀释过度。