📋 实验流程
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包被（捕获抗体）
过夜 / 2 h用包被缓冲液稀释捕获抗体，加入酶标板，4°C 过夜或 37°C 2 小时。
💡 技巧 包被后用洗涤液洗 3 次，去除未结合抗体。
⚠️ 注意 抗体浓度需预实验优化，过高会浪费、过低会不饱和。
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2
封闭
1 h加 BSA/脱脂奶粉封闭液，覆盖未结合的位点，减少非特异吸附。
💡 技巧 封闭液与包被抗体同种来源可减少交叉反应。
⚠️ 注意 封闭不充分会导致高背景。
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3
加样（抗原/标准品）
1–2 h加入标准品（做标准曲线）和待测样品，室温孵育。
💡 技巧 标准品做梯度稀释（如 2 倍或 10 倍），样品设复孔。
⚠️ 注意 加样要快且一致，减少孔间误差。
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4
加检测抗体
1–2 h加入生物素标记的检测抗体，与捕获的抗原结合。
💡 技巧 检测抗体与捕获抗体需识别不同表位（夹心法关键）。
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5
加酶标物（HRP-链霉亲和素）
30 min加入 HRP 标记的链霉亲和素，与生物素高亲和结合。
💡 技巧 此步后要彻底洗涤，未结合的酶标物会导致高背景。
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6
显色与读数
30 min加 TMB 底物显色，加终止液终止反应，450nm 读 OD 值，标准曲线定量。
💡 技巧 显色时间固定（如 15–20 分钟），到点即终止，保证可比性。
⚠️ 注意 TMB 避光，终止液（硫酸）有腐蚀性。
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⚠️ 新手常犯的 4 个错误（避坑指南）
- ① 洗涤不充分：背景高、假阳性，每步都要洗 3 次。
- ② 边缘效应：酶标板边缘孔温度不均导致读数偏差，可用封板膜。
- ③ 标准曲线不好：标准品稀释不当，R² < 0.99 需重做。
- ④ 样品浓度超出线性范围：OD 超出标准曲线，需稀释样品重测。
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+背景很高怎么办？
检查：① 洗涤是否充分 ② 封闭是否足够 ③ 抗体浓度是否过高。
+标准曲线 R² 低怎么办？
检查标准品稀释是否准确、是否过期，重新梯度稀释并设复孔。
+信号很弱/无信号怎么办？
排查：① 抗体配对错误 ② 忘了加某组分 ③ 样品不含目标物 ④ 底物失效。