📋 实验流程
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准备工作（无菌环境）
30 min紫外照射生物安全柜，消毒台面，准备无菌耗材与试剂。
💡 技巧 所有进入超净台的东西都喷 75% 酒精。
⚠️ 注意 操作时手从物品上方过，不遮挡气流。
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2
复苏细胞
20 min从液氮取出冻存管，37°C 快速融化，离心去冻存液，接种到培养皿。
💡 技巧 37°C 水浴快速融化（1–2 分钟内），减少冰晶损伤。
⚠️ 注意 冻存液含 DMSO，复苏后必须离心去除，否则影响细胞。
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3
换液
15 min吸去旧培养基，PBS 清洗，加入新鲜完全培养基。
💡 技巧 换液前培养基 37°C 预热，避免冷刺激。
⚠️ 注意 PBS 清洗要轻柔，避免冲起贴壁细胞。
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4
传代（胰酶消化）
30 min细胞长到 80–90% 融合时，胰酶消化，终止后按比例传代。
💡 技巧 胰酶消化时间宁短勿长，镜下观察细胞变圆即终止。
⚠️ 注意 悬浮细胞无需胰酶，直接离心换液传代。
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5
细胞计数
15 min台盼蓝染色，计数板统计活细胞数，保证接种密度一致。
💡 技巧 台盼蓝拒染的活细胞，蓝色为死细胞。
⚠️ 注意 计数前充分吹打混匀，避免细胞团影响计数。
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6
冻存细胞
30 min消化后重悬于含 DMSO 的冻存液，程序降温至 -80°C 后转液氮。
💡 技巧 慢冻快融，用程序降温盒或梯度降温。
⚠️ 注意 冻存液 DMSO 终浓度 5–10%，现配现用。
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 污染：最常见是支原体污染，定期检测，严格无菌操作。
- ② 胰酶消化过度：细胞膜受损、活力下降，镜下变圆即终止。
- ③ 传代过晚：过度融合导致接触抑制、分化，应在 80–90% 时传代。
- ④ 复苏冻存不当：慢冻快融做反了，细胞大量死亡。
- ⑤ 血清批次不一致：不同批次 FBS 影响细胞状态，尽量锁定批次。
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+细胞长得慢/状态差怎么办？
检查：① 血清质量/批次 ② 培养基是否过期 ③ 是否支原体污染 ④ 传代比例。
+怎么判断是不是支原体污染？
细胞生长变慢、形态改变但培养基不变浑浊。用 PCR 检测试剂盒确诊。
+贴壁细胞突然成片脱落怎么办？
可能是过度融合、营养耗尽、pH 改变或污染。及时换液、传代，排查污染。